DNA合成の基本原理

化学的 DNA 合成は、固相合成戦略とホスホルアミダイト化学に基づいています。生物学的 DNA 合成とは異なり、化学的 DNA 合成では、図 1 に示すように、DMT (4, 4-ジメトキシトリチル) とホスホルアミダイト修飾デオキシリボキシシドが材料となります。 DNA 合成は固体支持体上で実行されます (さまざまな種類の DNA 合成が可能です)。オリゴ合成カラム)、つまり CPG (制御細孔ガラス) と PS (ポリスチレン) を使用し、合成全体がDNA/RNA合成装置当社の主力設備であるHYシングルチャンネルシンセサイザー、HY-12、HY-192などのモデルがあり、合成方向は3'から5'で、ヌクレオチドは1本を介して固体支持体に導入されます。合成サイクル。一般的な合成サイクルには、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の 4 つのステップが含まれます (図 2)。脱保護は、固体支持体上の DMT 基または前のヌクレオシドの 5' ヒドロキシル基を除去するように設定されており、ジクロロメタン中の 3% トリクロロ酢酸が脱保護試薬として使用されます。次に、ホスホラミダイト修飾デオキシリボキシシドを、活性化剤、すなわち、5-エチルチオテトラゾールまたは4,5-ジシアノイミダゾールの助けを借りてヒドロキシル基を露出させ、ホスファイトトリエステル(III)を形成し、カップリングステップを実現した。キャッピングステップは、カップリングステップ中に未反応のヒドロキシル基をブロックし、望ましくない欠陥配列の形成を最小限に抑えるために実行されます。最後に、不安定なホスファイトトリエステル (III) は、ピリジンの存在下で酸化剤としてヨウ素を使用して化学的に安定なホスファイトトリエステル (V) に酸化されます。

合成された DNA はアミノリシスによって固体支持体から切断され、ホスホトリエステル上の 2-シアノエチル保護基と核酸塩基上のアミドが同時に切断されます。ラック内の合成プレートと合成カラムは反応チャンバーに直接配置されます。の脱保護装置。粗製 DNA はオンデマンドで HPLC、電気泳動、OPC によって調製できます。浄化装置後処理用。