核酸合成の原理

核酸合成は固相シアルアミドトリグリセリド法を使用して行われます。これにより、DNAの3'末端が固相基板上に固定され、目的のDNA断片が合成されるまでヌクレオチドが3'から5'方向に追加されます。 。これは、DNA ポリメラーゼの適用による DNA 合成とは異なります。

最初の塩基の 3' 末端は合成中に CPG に固定化され、次の塩基の 5'-OH はジ-p-トリルトリチル DMT で保護され、塩基のアミノ基は安息香酸で保護され、3' 末端は次に、-OH はアミノリン酸塩化合物で活性化されます。1 塩基の 5'-OH の 1 塩基と次の塩基の 3'-OH が亜リン酸トリグリセリドを形成し、これがヨウ素でリン酸トリグリセリドに酸化され、2 番目の塩基 5'-OH 上の保護剤が除去されます。ジクロロ酢酸の添加 次の塩基の添加による DM サイクル、および合成後、5'-OH 上の保護剤が弱酸で除去されます フラグメントは濃水酸化アンモニウムで固体樹脂から切り離され、保護剤が塩基から除去されます加熱下、濃水酸化アンモニウムで処理し、水酸化アンモニウムを除去し、断片を真空乾燥し、液体クロマトグラフィーまたはPAGEにより核酸を精製する。

オリゴ合成の手順

ブロック解除

の5末端DMT保護基はTCA溶液を添加することで除去されます。

アクティベーション

活性化剤をオリゴヌクレオチドモノマーと混合して、活性オリゴヌクレオチドモノマー中間体を形成する。

カップリング

5 末端ヒドロキシル基は、抗生成縮合反応で活性オリゴヌクレオチド中間体と反応して、不安定な亜リン酸トリグリセリド結合を形成します。

キャッピング 

キャッピング剤を添加すると、縮合反応に関与しない過剰なヒドロキシル基とのアセチル化キャッピング反応が行われます。

酸化 

水を含むヨウ素溶液を添加すると、不安定なホスファイト結合と酸化反応して、安定なリン酸トリグリセリド結合が形成されます。

シアノエチル切断

リン酸トリグリセリド結合からシアノエチル基を除去するために DEA 溶液を添加した合成後の核酸生成物。

切断&脱保護

核酸フラグメントは、濃水酸化アンモニウム溶液を添加することによって固相担体から切断され、その後加熱して塩基の水素結合から保護基を除去します。